英國(guó)Whatman3MM CHR雜交層析紙

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

掌握RNA印跡技術(shù)的基本原理，學(xué)習(xí)RNA印跡技術(shù)的操作方法，了解RNA印跡技術(shù)的意義與應(yīng)用。

【實(shí)驗(yàn)原理】

將RNA變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用于與DNA探針雜交以鑒定其中特定RNA分子的大小與含量。基本原理與Southern印跡相同，但RNA變性方法與DNA不同，不能用堿變性，因?yàn)閴A會(huì)導(dǎo)致RNA的水解。

Northern印跡主要用于組織細(xì)胞靶基因表達(dá)水平的研究以及對(duì)同一組織細(xì)胞的不同基因間的表達(dá)水平進(jìn)行比較，或者對(duì)不同組織細(xì)胞間相同基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較。

英國(guó)Whatman3MM CHR雜交層析紙【實(shí)驗(yàn)對(duì)象】

待測(cè)RNA樣品。

【試劑與器材】

1． 焦碳酸二乙酯 （DEPC）。

2． 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳所需試劑。

3． 0.5 mol ／ L乙酸銨（NH4Ac）。

4． 溴化乙啶 （EB）：0.5μg／ml，溶于0.5mol／L乙酸銨中。

5． 0.05mol ／ L NaOH／1.5mol／L NaCI（選用）。

6． 0.5mol ／ L Tris·CI （pH 7.4） ／1.5mol／L NaCl（選用）。

7． 20×SSC、6×SSC和2×SSC。

8． 亞甲藍(lán)（終濃度為0.03％），溶于0.3mol ／ L （pH 5.2）的乙酸鈉緩沖液中 （選用）。

9． *纖維素 （NC） 膜或尼龍膜。

【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】

1. RNA甲醛變性凝膠電泳（5V/cm, 3h）,（見(jiàn)附錄三）。

電泳結(jié)束后用EB染色：取出凝膠，切下需要染色的泳道，放置于無(wú)RNA酶的玻璃平皿，加入0.5mol ／L乙酸銨浸泡20min。換液再浸泡20min以除去甲醛，將凝膠轉(zhuǎn)入含0.5（g ／ ml EB的0.5mol ／L乙酸銨溶液中染色40min，必要時(shí)，以0.5mol ／ L乙酸銨脫色1h。

3．在紫外透射儀中使凝膠中的RNA顯跡，沿凝膠的邊緣放一把尺子拍照，以便隨后能確定膜中的條帶。

4．將非染色的部分凝膠放置于無(wú)RNA酶的玻璃平皿中，加足夠的DEPC處理的去離子水浸洗幾次以除去甲醛。

5. 凝膠浸泡在10倍體積的0.05mol/L NaOH ／ 1.5mol/LNaCl中30min，使RNA部分水解。接著浸泡于10倍體積的0.5mol/L Tris·C1（pH 7.4） ／ 1.5mol/LNaCl緩沖液中和30min （可選）, 將膠的多余部分切除，并切邊標(biāo)記。

6． 將溶液換成10倍體積的20×SSC，浸泡45min。

7． 在一玻璃或塑料平皿中放置-塊比凝膠略大的有機(jī)玻璃作為平臺(tái)（必要時(shí)，可并排放兩塊或更多） ，加入足夠的20×SSC以使平臺(tái)半淹沒(méi)在液體中。

8． 構(gòu)筑轉(zhuǎn)移平臺(tái)，剪3張與平臺(tái)同樣大小的Whatman 3MM濾紙，放在平臺(tái)表面，以20×SSC潤(rùn)濕。把凝膠置于濾紙表面，用玻棒滾動(dòng)表面以壓擠去除氣泡。切4條塑料保鮮膜覆蓋在凝膠的邊緣。

9．剪一片與凝膠暴露面積大小相當(dāng)?shù)哪猃埬せ騈C膜，在一個(gè)無(wú)RNA酶的玻璃平皿中加入約0.5mm深的用DEPC處理的去離子水，將膜漂在水面使之潤(rùn)濕，直至膜沉沒(méi)在水中。如果是尼龍膜，只需讓膜在水中泡上5min，如果是NC膜，則換成20×SSC再浸泡10min。

10．將潤(rùn)濕的膜放在凝膠表面，用干凈刀片切去濾膜一角，使其與凝膠的切角相對(duì)應(yīng)，排去氣泡，以20×SSC漂洗膜表面。切 3張與膜大小相當(dāng)?shù)臐駶?rùn)的Whatman3MM濾紙，放于膜的表面。趕出氣泡。然后將與膜大小相當(dāng)?shù)募埥碚R地堆放在濾紙的表面，高約4cm。

11． 在紙堆的頂部放一塊玻璃平板，壓一重物 （0.2～0.4kg），放置12h左右。

12．拆卸轉(zhuǎn)移裝置，回收膜和壓扁了的凝膠。在膜上用鉛筆標(biāo)上加樣孔的位置和方向。

13．用2×SSC洗膜，然后放于濾紙上，讓膜于室溫干燥30分鐘。NC膜則應(yīng)夾于2張Whatman 3MM濾紙之間，80℃真空干烤2h。將干的轉(zhuǎn)印膜置于可透過(guò)紫外線的塑料保鮮膜中，帶有RNA的一面朝下，置于紫外透射儀（波長(zhǎng)在254nm）上，以合適的照射強(qiáng)度進(jìn)行紫外線交聯(lián),以固定RNA。備作核酸雜交。

14． 凝膠可按步驟2，用EB染色以檢查轉(zhuǎn)印效率。